樣品準備（將五羥色胺轉變?yōu)?/span>N-乙酰五羥色胺）是樣品的稀釋的一部分，將每一份樣品分別于?；噭┮黄饻赜涂梢缘玫锦；奈辶u色胺。此實驗采用的是競爭性ELISA的原理，生物素標記的和非生物素標記的抗原競爭性結合到一定數量的抗體結合位點上。zui后，結合到抗體上的生物素標記抗原的量于樣品中被分析物的濃度成反比。當反應系統(tǒng)達到平衡后，洗板除去未結合的生物素標記抗原，用抗生物素堿性磷酸酶做標記、對硝基苯磷酸做底物來檢測結合到抗體上的生物素標記抗原的量。用已知標準品做一條標準曲線，將未知樣品的酶活性在標準曲線上進行定標就可以得到未知樣品中五羥色胺的濃度。
| 注意 | 有些食物會含有一定量的五羥色胺，另外，有些藥物也會刺激五羥色胺的釋放，從而導致五羥色胺的濃度升高。病人應當禁食富含五羥色胺的食物，如：阿司匹林、促腎上腺皮質激素、MAO抑制劑、phenazetin、兒茶酚氨、利血平和煙堿。 |
| 注意靜脈穿刺采集全血的常規(guī)注意事項。從采集到血液樣品的那一刻起到檢測時都應保持血液樣品的化學整體性。不要使用明顯溶血、黃疸血和脂血樣品。如果樣品出現混濁，則在實驗前應當離心以除去所有的微粒物質。 | ||||
| 貯存 | 18-25℃ | 2-8℃ | ≤-20℃ | 避免熱源或太陽直射，避免反復凍融，冷凍狀態(tài)下運輸樣品。 |
| 穩(wěn)定性 | 2小時 | 6小時 | 3個月 | |
| 可以是自然尿液也可使用24h尿液。收集病人24h內的所有尿液，之后將其加入到10-15ml 6N的HCl防腐劑中。確定用于結果結算的總體積。使用前請將所有樣品混合并離心。 | ||
| 貯存 | ≤-20℃ | 避免熱源或太陽直射，避免反復凍融。 |
| 穩(wěn)定性 | 6個月 | |
| 98%以上的循環(huán)五羥色胺都位于血小板內，在血液凝集時就可以釋放出來。用靜脈穿刺的方法將全血收集到含EDTA或檸檬酸的塑料試管中（如10mlMonovette NC試管中加入1ml檸檬酸溶液）。 室溫下，將全血樣品以200×g的速率離心10分鐘得到富含血小板的血漿（PRP）。將PRP-上清轉移到另一試管中。 為了獲得血小板乳糜微粒，我們將200ulPRP（350000～500000個血小板/ul）加入到800ul生理鹽水中，之后4℃下以4500×g的速率離心10分鐘（或4℃下10000×g的速率離心2分鐘）。離心后棄取上清。在血小板乳糜微粒中加入200ul雙蒸水，之后樣品就可以在-20℃以下的環(huán)境下凍存數周了。 將凍融的樣品在室溫下以1000×g的速率離心2分鐘。整個實驗需要使用20ul上清液（見?；?。 如果您想測無血小板血漿（PFP）中五羥色胺的濃度，我們可以將PRP在4℃以4500×g的速率離心10分鐘（或4℃下10000×g的速率離心2分鐘）就可以獲得無血小板血漿（PFP）。游離五羥色胺的ELISA實驗要使用50ul上清液（見?；?/span> 注意：PRP中五羥色胺的直接檢測實驗表明：大約10%的PRP樣品可以檢測到不可預知的高濃度五羥色胺（結果用液相層析和流氏細胞術獲得）。為了避免這種差異性，我們建議您即檢測血小板中五羥色胺，也檢測無血小板血漿中的五羥色胺。 | ||||
| | 無血小板血漿 | 血小板微粒（從血漿中分離得到） | 避免熱源或太陽直射，避免反復凍融，冷凍狀態(tài)下運輸樣品。 | |
| 儲存 | ≤-20℃ | ≤-20℃ | ≤-80℃ | |
| 穩(wěn)定性 | 2周 | 4周 | 1年 | |
| 使用組織勻漿和細胞培養(yǎng)上清作樣品，一般無特殊注意事項 注意：細胞培養(yǎng)基可能含有一定量的五羥色胺！ | ||
| 儲存 | ≤-20℃ | 避免熱源或太陽直射，避免反復凍融。 |
| 穩(wěn)定性 | 6個月 | |
| 注意 | 試劑盒有足夠做96份單孔檢測或48份雙孔檢測所需的試劑成分。 |
| 數量 | 標記 | 成分 |
| 1×12×8 | MTP | 包被板，可拆，微孔中包被了羊抗兔抗血清。 |
| 1×5ml | ANTISERUM | 組胺抗血清，藍色，即用，內含：兔抗血清、 Tris緩沖液和0.01%的NaN3。 |
| 1×5ml | BIOTIN | 五羥色胺生物素，黃色，即用，內含0.1%的NaN3。 |
| 1×0.2ml | ENZCONJ CONC | 酶聯物，10倍濃縮， 內含堿性磷酸酶標記的抗生物素抗體、Tris緩沖液、HCl和0.01%的NaN3。 |
| 1×7×0.5ml | CAL A-G | 標準品A-G， 0;0.08;0.24;0.73;2.2;6.6;19.8ng/ml, 0;0.45;1.4; 4.1;12.5;37.4;112.3nmol/l, 即用，內含?；奈辶u色胺、磷酸鹽緩沖液和0.1%的NaN3。 |
| 1×2×0.5ml | CONTROL 1+2 LYO | 質控品1+2，凍干，內含人血清和0.02%的NaN3。 具體濃度及可允許范圍請見試劑瓶標簽。 |
| 1×3ml | ACYLREAG | 酰化試劑 內含乙酸酐和丙酮，即用 |
| 1×50ml | ASSAYBUF CONC | 檢測緩沖液，10倍濃縮，內含磷酸緩沖液、BSA和1%的NaN3。 |
| 1×50ml | WASHBUF CONC | 洗滌液，20倍濃縮，內含磷酸緩沖液、吐溫和0.1%的硫柳汞。 |
| 1×9× | PNPP SUBS | PNPP底物片，密封于鋁鉑金屬袋內，內含對硝基苯酚磷酸鹽。 |
| 1×27ml | PNPP BUF | PNPP底物緩沖液，即用，內含二乙醇胺、水和0.05%的NaN3。 |
| 1×15ml | PNPP STOP | PNPP終止液，即用，內含1M的NaOH和0.25M的EDTA。 |
| 3× | FOIL | 粘性金屬板 |
2） 玻璃試管（12×75mm）
7） 帶儲器的8道移液器
10） 可在405nm處讀數的酶標儀（參考波長：600-650nm）
11） 雙蒸水或去離子水
12） 吸水紙、取樣吸頭和計時器
| 注意 | 用于96孔檢測的試劑成分可分成3次用。下述體積是使用4條（32孔）時所需要的體積。如果客戶想將標準品從7支減為6支的話，我們可以省掉標準品G。則檢測范圍相應的減少到155ug/l（血漿）或706ug/l（血清，尿液，組織勻漿和細胞培養(yǎng)上清）。 血清、尿液、組織勻漿和細胞培養(yǎng)上清樣品可以選擇簡短操作步驟進行，只需溫育3.5個小時（但血漿樣品不能采用簡短操作步驟進行），以上樣品也可以選擇可選操作步驟進行檢測（將樣品溫育一整夜），血漿樣品必須按照溫育一整夜進行檢測。 |
| 稀釋/溶解 | 成分 | 加入 | 稀釋劑 | 比例 | 備注 | 儲存 | 穩(wěn)定性 |
| 15ml | 檢測緩沖液 | 150ml | 雙蒸水 | 1:10 | 出現黃褐色并不會影響實驗結果 | 2-8℃ | 2周 |
| 15ml | 洗滌液 | 300ml | 雙蒸水 | 1:20 | | 2-8℃ | 4周 |
| | 質控品 | 0.5ml | 雙蒸水 | | 靜置15min,混合時無泡沫 | ≤-20℃ | 有效期內穩(wěn)定 |
| 60ul | 酶聯物 | 6ml | 稀釋的檢測緩沖液 | 1:101 | 臨時配置,只能使用一次 | 18-25℃ | 2小時 |
| 3 | PNPP底物片 | 8ml | PNPP底 物緩沖液 | | 臨時配置，只能使用一次 | 18-25℃ | 5小時 |
| 注意 | 請不要酰化標準品，標準品已經?；?。 樣品準備可使血清、尿液、血小板乳糜微粒、組織勻漿和細胞培養(yǎng)上清被稀釋107倍，而血漿樣品則被稀釋23.5倍。結果計算時必須將此稀釋因子考慮進去。 |
| 1 | 將質控品和樣品A分別20ul加入到玻璃試管中。 |
| 2 | 在每一試管中加入100ul稀釋好的檢測緩沖液，旋渦混合。 |
| 3 | 在每一試管中加入25ul?；噭?/span>1（3%），加入后立即旋渦混合。 |
| 4 | 將試管蓋好，將試管放到37℃水浴箱內溫育15分鐘。 |
| 5 | 在每一試管中加入2ml已稀釋好的檢測緩沖液，旋渦混合 |
| 6 | 1500×g下離心10分鐘 |
| 注意 | 準備好的樣品必須立即檢測。其上清可在18-25℃下穩(wěn)定存放1小時。 |
| 1 | 將50ul樣品B加入到玻璃試管中。 |
| 2 | 在每一試管中加入100ul稀釋好的檢測緩沖液，旋渦混合。 |
| 3 | 在每一試管中加入25ul?；噭?，加入后立即旋渦混合。 |
| 4 | 將試管蓋好，將試管放到37℃水浴箱內溫育15分鐘。 |
| 5 | 在每一試管中加入1ml已稀釋好的檢測緩沖液，旋渦混合 |
| 6 | 1500×g下離心10分鐘 |
| 注意 | 準備好的樣品必須立即檢測。其上清可在18-25℃下穩(wěn)定存放1小時。 |
| 1 | 將標準品、?；玫馁|控品和?；玫臉悠犯?/span>50ul加入到相應的微孔中。 |
| 2 | 在每一微孔中加入50ul五羥色胺生物素。 |
| 3 | 在每一微孔中加入50ul五羥色胺抗血清。 |
| 4 | 蓋板，室溫（18-25℃）下振蕩（500rpm）溫育90min。 |
| 5 | 移去粘性金屬板，棄取孔內反應液，每孔用250ul稀釋好的洗滌液洗板3次,吸水紙上拍干以除去殘余液體。 |
| 6 | 在每一微孔中加入150ul臨時準備好的酶聯物。 |
| 7 | 蓋板，室溫（18-25℃）下振蕩（500rpm）溫育60min。 |
| 8 | 移去粘性金屬板，棄取孔內反應液，每孔用250ul稀釋好的洗滌液洗板3次,吸水紙上拍干以除去殘余液體。 |
| 9 | 如果有條件的話，可以用8道移液器加底物液和終止液。加底物液和終止液時，每孔間的時間間隔應當相同。使用主動置換型移液器并避免氣泡產生。 |
| 10 | 在每一微孔中加入200ul臨時配置好的PNPP底物液。 |
| 11 | 室溫（18-25℃）下振蕩（500rpm）溫育60min。 |
| 12 | 在每一微孔中加入50ul PNPP終止液以終止底物反應，輕輕振板以使溶液混合均勻。 |
| 13 | 加終止液后60min內405nm處讀取OD值。 |
| 1 | 將標準品、?；玫馁|控品和樣品分別50ul加入到相應的微孔中。 |
| 2 | 在每一微孔中加入50ul五羥色胺生物素。 |
| 3 | 在每一微孔中加入50ul五羥色胺抗血清。 |
| 4 | 蓋板，輕輕振板，2-8℃下溫育16-20小時（一整夜）。 |
9.2.2第二天
| 1 | 移去粘性金屬板，棄取孔內反應液，每孔用250ul稀釋好的洗滌液洗板3次，吸水紙上拍干以除去參與液體。 |
| 2 | 在每一微孔中加入150ul臨時配置好的酶聯物。 |
| 3 | 蓋板，室溫振蕩器上（500rpm）溫育60分鐘。 |
| 4 | 移去粘性金屬板，棄取孔內反應液，每孔用250ul稀釋好的洗滌液洗板3次，吸水紙上拍干以除去殘余液體。 |
| 5 | 如果有條件的話，可以用8道移液器加底物液和終止液。加底物液和終止液時，每孔間的時間間隔應當相同。使用主動置換型移液器并避免氣泡產生。 |
| 6 | 在每一微孔中加入200ul臨時配置好的PNPP底物液。 |
| 7 | 室溫振蕩器上（500rpm）溫育30分鐘。 |
| 8 | 在每一微孔中加入50ul PNPP終止液，振板以混合孔內成分。 |
| 9 | 加終止液后60min內405nm處讀取OD值。（參考波長：600-650nm） |
將所有標準品、質控品和樣品的OD值減去空白孔的OD值。在半對數坐標紙上，以標準品的OD值（Y軸，線性）對其濃度（X軸，對數）繪制出一條標準曲線，或采用自動計算的方法繪制出一條標準曲線。用Cubic spline、4參數或雙對數可以得到較好的曲線圖。在計算標準曲線時，應當應用到每一個標準品數值（兩個數值中，明顯逸出的數值應當被忽略掉，采用更加合理的一個數值用）。樣品的濃度可以從標準曲線上定量得到。
| 樣品 | 數量 | 單位 | 平均值 | 范圍 |
| 血清 | 99 | ng/ml | 88.6 | 30-200 |
| 無血小板血漿 | 35 | ng/ml | 3.7 | 1.8-7.5 |
| 血小板 | 35 | ng/109血小板 | 490 | 217-861 |
| 24小時尿液 | 49 | μg/d | 83.1 | ≤200 |
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