DRG瘦素ELISA試劑盒
（德國DRG: EIA-2395）
1、說明
DRG公司的瘦素酶免試劑盒可用于人血清和血漿中瘦素的定量檢測。此檢測試劑盒僅供體外診斷用。
2、實驗原理
DRG公司的瘦素酶免實驗是一種基于夾心法原理的固相酶免吸附實驗（ELISA）。反應(yīng)板上的微檢測孔包被有能結(jié)合瘦素分子上*抗原位點的單克隆抗體。一份含有內(nèi)源性瘦素的病人樣本在包被孔中與特異性兔抗瘦素抗體進行孵育，之后就會形成一個夾心復(fù)合物。孵育后，用洗滌液洗去未結(jié)合的物質(zhì)，再加入過氧化物酶標記的抗兔抗體以檢測結(jié)合在包被板上的瘦素的量。加入底物溶液后，顯出的顏色強度與病人樣品中瘦素的濃度成正比。
3、試劑盒成分
1） 包被板，12×8孔，可拆，微孔中包被了抗瘦素抗體（單克?。?/span>
2） 標準品（0-5），6支 凍干型0.5mL，濃度：0,2,5,25,50,100ng/ml，內(nèi)含0.3%的Proclin防腐劑
3） 質(zhì)控品， 2支，200ul，即用，2個濃度（低與高），具體數(shù)值與范圍請見試劑瓶標簽或QC質(zhì)控單。內(nèi)含0.3%的Proclin防腐劑。
4） 實驗緩沖液，1支，11ml，即用，內(nèi)含0.3%的Proclin防腐劑
5） 抗血清，1支，11ml，即用，單克隆瘦素抗血清，內(nèi)含0.3%的Proclin防腐劑。
6） 酶復(fù)合物，1支，11ml ，即用，辣根過氧酶標記的抗兔復(fù)合物，內(nèi)含0.3%的Proclin防腐劑
7） TMB底物液，1支，14ml，即用
8） 終止液，1支，14ml，即用，內(nèi)含0.5M的H2SO4，避免接觸終止液，以免刺激皮膚或灼燒皮膚。
9） 洗滌液（40×），1支 30ml
注：零標準品應(yīng)視需要而定。
4、實驗所需器材（但試劑盒不提供）
1） 酶標儀 （450±10nm）（如DRG 公司的酶標儀）
2） 取樣槍
3） 吸水紙。
4） 蒸餾水
5、貯存條件
未開啟的試劑在2—8℃下貯存，在有效期內(nèi)可以保持活性。不要使用過期試劑。酶聯(lián)物、底物溶液、標準品和零標準品必須在2—8℃下貯存。
微孔反應(yīng)板必須在2—8℃下貯存。一旦包裝袋被打開，必須將它小心地嚴封起來。
6、樣品采集
1） 血清：靜脈穿刺采集全血，待其凝血，在室溫下離心分離血清。未*凝血前請勿離心，接受了抗凝劑治療的病人樣品可能需要更長的凝血時間。
2） 血漿：將全血采集到含有抗凝劑的離心管，采集后立即離心分離。
3） 樣品的儲存：實驗開始前應(yīng)用蓋子將樣品密封好，2-8℃下可存放24個小時，如實驗之前需將樣品貯存更長的時間，應(yīng)當(dāng)將樣品凍存于-20℃的環(huán)境下，并且只能凍存一次，不能反復(fù)凍存。解凍的樣本在實驗之前必須要上下倒置幾次。
7、樣品的稀釋：
在*次實驗中，要是樣品的濃度高于zui高標準品，則樣品應(yīng)用按實驗步驟所描述用零標準品進行稀釋，并重新檢測。并且在計算濃度時需乘上此稀釋因子。
例子：
a） 按1：10稀釋： 10μL的血清+90μL的零標準品（充分搖勻）。
b） 按1：100釋稀：10μL按a）稀釋的血清+90μL的零標準品（充分搖勻）
8、實驗步驟
所有的標準品、質(zhì)控品和樣品都必須做雙份檢測以確保所有的檢測條件都一樣。每一次實驗都有一條標準曲線。
1）將所需數(shù)目的板條置于板架上。。
2）用一次性吸嘴將標準品﹑質(zhì)控品和樣品分別15μL加入相應(yīng)的檢測孔中。
3）每孔加入100μL的檢測緩沖液。
4）充分混合10秒，在此步驟中充分混合非常重要。
5）室溫下溫育120分鐘。
6）快速棄去檢測孔中的內(nèi)含物，每孔用300μL洗滌液洗板三次，在吸水紙上拍干以除去殘余液體。注意：洗板步驟是否正確操作會明顯影響實驗的靈敏度和度。
7）每孔加入100μL抗血清。
8）在室溫下溫育30分鐘。
9）快速棄去檢測孔中的內(nèi)含物，每孔用300μL的洗滌液洗板三次，在吸水紙上拍干以除去殘余液體。
10）每孔加入100μL酶聯(lián)物。
11）在室溫下溫育30分鐘。
12）快速棄去檢測孔中的內(nèi)含物，每孔用300μL的洗滌液洗板三次，在吸水紙上拍干以除去殘余液體。
13）每孔加入100μL底物液。
14）室溫溫育15分鐘。
15）每孔加入50μL終止液以終止酶反應(yīng)。
16）在加終止液后10分鐘內(nèi)于450±10nm處讀取OD值。
9、結(jié)果計算
1） 計算每個標準品、質(zhì)控品和病人樣本的平均吸光度值。
2） 用吸光度值作為縱坐標（y），濃度值作為橫坐標（x），以每個標準品的吸光度值對其相應(yīng)的濃度值進行標繪，作一標準曲線。
3） 用每一樣品的平均吸光度值在標準曲線上確定其相應(yīng)的濃度。
4） 自動計算方法：在IFU上，它用四參數(shù)曲線已自動計算出結(jié)果。其它的歸納方法可能會得出稍微不同的結(jié)果。
5） 樣品的濃度可直接從標準曲線上讀取。樣品中HPL濃度高于zui高標準品的必須用進行進一步的稀釋。在計算樣品濃度時就應(yīng)當(dāng)把此稀釋因子考慮進去。
10、參考值
我們強烈建議各個實驗市都建立自己的正常值和異常值。以下結(jié)果是以一定量正常人群的血液樣本為準得出的實驗結(jié)果：
| 人群 | ng/ml |
| 男性 | 3.84 ± 1.79 |
| 女性 | 7.36 ± 3.73 |
本譯文僅供參考，詳情請以原文為準。
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